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研究室の出来事 2024年度 ⑩
「培養細胞の発見を個体へ、個体の発見を培養細胞へ」
～In vitro から in vivo へ。In vivo から in vitro へ～
2025年 2月
今日は、研究室のみんなで魚を飼育する準備をしました。この2年間の研究で、私たちは魚の培養細胞を用いて魚病を引き起こすウイルスに対して抗ウイルス活性を持つ天然物の抽出液や化合物を明らかにしています。
そこで、培養細胞の実験 (in vitro) で分かったことを、魚を用いて生体実験 (in vivo) へ発展することにしました。培養細胞レベルで感染を抑える化合物が魚でも感染を抑えれるのか？を調べます。そして、魚を用いて新たに発見することを、培養細胞レベルで、どうして感染が抑えれるのか？を調べていきたいと思います。細胞レベルで分かったことを生体レベルで調べる。そして生体レベルで分かったことを細胞レベルで調べる。これが私たちの研究室の強みです。
研究室の出来事 2024年度 ⑨
「卒業論文の発表」
2025年 2月
4年生の卒論発表会がありました。
手を動かして実験をする。結果をまとめて、プレゼン資料を作る。
この研究の流れを、4年生3人は、きちんと行いました。発表内容、発表態度ともに素晴らしかったです。お疲れさまでした。
研究室の出来事 2024年度 ⑧
「研究室の大掃除をしました」
2024年 12月
年末の大掃除をしました。研究室の荷物を出してワックスをかけ、研究室はピカピカになりました。夜は、忘年会を行いました。1年間、お疲れさまでした。
来年も、良い研究をし、飛躍の1年にしましょう。
良い研究は、良い人生を導きます。
研究室の出来事 2024年度 ⑦
「新型コロナウイルス SARS-CoV-2 感染を抑制する乳製品を明らかにしました」
2024年 9月
Yasuhiro Hayashi, Sei Arizono, Takashi Tanikawa
Comparison of anti-SARS-CoV-2 activity of commercial dairy products
Journal of Dairy Research, 2024
大事な点です。本研究は、あくまで細胞レベルでの感染抑制実験です。
ヒトおよび動物レベルで、感染予防を保証するものではありません。ご注意ください。
新型コロナウイルス SARS-CoV-2 感染を抑制する乳製品を明らかにしました。SARS-CoV-2 特異的な治療法は世界中で既に確立されつつあります。しかしながら、今夏には、新しい変異株 KP.3 株が海外だけでなく国内でも主流株として出現し、いまだ SARS-CoV-2 感染流行には終わりが見えない状況です。そこで、SARS-CoV-2 感染に予防効果がある牛乳乳製品を探索しました。
11種類の牛乳乳製品を、それぞれ凍結乾燥し、50 mg/mL 濃度で精製水を用いて溶解し、牛乳乳製品サンプルとしました。アフリカミドリザル腎臓細胞 VeroE6/TMPRSS2 株に牛乳乳製品サンプルで処理し（250 ~4,000 mg/mL）、臨床分離したSARS-CoV-2オミクロン株 (BA.2) を感染させた後、ウイルス増殖による細胞死滅の割合を測定し、抗ウイルス活性を評価しました。すると、アイクレオ赤ちゃんミルクにおいて、調べた牛乳乳製品サンプルの中
では、高い抗SARS-CoV-2 活性（50% 効果濃度: EC50=1,355 mg/mL）が検出されました。さらに、牛乳乳製品の抗SARS-CoV-2活性の抑制機構を調べるために、SARS-CoV-2の侵入過程を評価するシュードタイプ水疱性口内炎ウイルスを用いて牛乳乳製品サンプルのSARS-CoV-2の侵入抑制効果を調べました。すると、明治プロビオヨーグルトR-1 （EC50=1,744 mg/mL）、ヤクルト（EC50=3,475 mg/mL）において、SARS-CoV-2の侵入過程を抑制することが分かりました。
本研究は城西大学の谷川先生との共同研究であり、一般社団法人Jミルク「牛乳乳製品健康科学会議」の助成を受けたものです。
研究室の出来事 2024年度 ⑥
「夏の研究室体験」2024年 8月
夏の研究室体験を行いました。参加者は、中学3年 野球部 の子供達です。挨拶がきちんとできる気持ちの良い野球小僧たちです。遺伝の仕組みを勉強した後、ヒト培養細胞からゲノム抽出を行いました。その後は、大学の喫茶店でソフトクリームを食べました。大学キャンパスそして研究室の雰囲気を感じてもらえたなら嬉しいです。
高校受験で悩むことも多いと思います。それも青春ですので、頑張ってください。応援しています。
研究室の出来事 2024年度 ⑤
「ヒト免疫不全ウイルス 感染に関わるスフィンゴミエリン合成酵素の近接タンパク質を
発見しました」 2024年 6月
Yasuhiro Hayashi, Takehiro Suzuki, Naoto Horioka, Naoshi Dohmae, Takashi Tanikawa
Biological and Pharmaceutical Bulletin, 47, 1136-1143, 2024
スフィンゴミエリン合成酵素の近接タンパク質を発見しました。スフィンゴミエリンはセラミドにホスホコリンが結合した構造をしており、ヒト生体内で最も含有量の多いスフィンゴ脂質です。最近の研究で、スフィンゴミエリンが発ガンやメタボリックシンドローム発症などに関与することが分かってきており、私達もスフィンゴミエリン合成酵素がヒト免疫不全ウイルスの侵入を促進することを明らかにしています (Hayashi et al., Journal of Biological Chemistry, 2014)。
スフィンゴミエリン合成の原料となるセラミドは小胞体膜上で合成され、セラミド輸送タンパク質 により小胞体からゴルジ体の細胞質側に運ばれます。しかしながら、SM 合成酵素の活性残基はゴルジ体の内腔側に存在するため、スフィンゴミエリンが産生されるためには、ゴルジ体で細胞質側のセラミドが脂質二重膜を横断し内腔側に輸送されなければいけません。ゴルジ体膜上におけるセラミドの脂質二重層間の移動機構は未解明であり、私たちの体の中で、どうやってスフィンゴミエリンが合成されるのかは完全には理解できていません。そこで、スフィンゴミエリン産生の missing link であるゴルジ体に局在するセラミドフロッパーゼを同定することを目指しました。
近位依存性ビオチン標識法でセラミドフロッパーゼの同定に挑戦しました。大腸菌由来ビオチンリガーゼ Turbo は、半径 10 nm の範囲のタンパク質のアミン基を短時間でビオチン化でき、強い相互作用のみならず、一時的な弱い相互作用も検出可能です。スフィンゴミエリン合成酵素に Turbo 遺伝子を付加させたキメラ遺伝子をヒト培養細胞に発現させ、ビオチン化されたタンパク質（スフィンゴミエリン合成酵素の近くに存在するタンパク質）を回収しました。理化学研究所の堂前先生グループとの共同研究で Orbitrap LC-MS/MS を用いてビオチン化タンパク質の同定を行い、約 800 個のタンパク質を同定しました。同定したタンパク質の中から、フロッパーゼ活性領域を持つタンパク質に注目した結果、Phospholipid Scramblase 1 というタンパク質がスフィンゴミエリン合成酵素に近接することを明らかにしました。Phospholipid Scramblase 1 は細胞膜の脂質二重層の 2 つの単層間でのリン脂質の移動を担うタンパク質として発見されていますが、スフィンゴミエリン合成との関りは未報告でした。
そこで、私たちは早速、CRSIPR/Cas9 ゲノム編集を用いて、Phospholipid Scramblase 1 ノックアウト細胞をヒト培養細胞から作製しました。液体クロマトグラフィ—質量分析で細胞内の スフィンゴミエリン量を定量しましたが、残念なことに、スフィンゴミエリン量に変化はありませんでした。諦めの悪い私たちは、Phospholipid Scramblase 1 のみならず、そのファミリー遺伝子（遺伝子配列が似ている遺伝子）もノックアウトし、最終的には Phospholipid Scramblase 1, 3, 4 の 3つの遺伝子を破壊したトリプルノックアウト細胞を作製しました。ところが、幸福の女神は私達には微笑むことなく、トリプルノックアウト細胞でもスフィンゴミエリン量に変化はありませんでした。
研究結果は、私たちの期待とは違いましたが、スフィンゴミエリン合成酵素と Phospholipid Scramblase 1 が近くに存在しあうという事は誰も知らなかった発見です。近接する生理的な意義を明らかにすることが今後の課題です。
本研究は理化学研究所の堂前先生・鈴木先生、城西大学の谷川先生との共同研究です。
研究室の出来事 2024年度 ④
「美味しいメロンありがとうございます」2024年 7月
今年も、北海道出身の吉田君がルピアレッド「ふらのメロン」をごちそうしてくれました。ご両親が送って頂いたメロンのお裾分けです。とても美味しかったです。
良い研究をして、ご両親を安心させてくださいね。
研究室の出来事 2024年 ③
「さぁ、発見しよう」2024年 7月
海洋生物からの抗ウイルス活性のスクリーニングが終わると、次は、なぜ「その化合物は抗ウイルス活性を持つのか？」という好奇心に変わります。B型肝炎ウイルスに抗ウイルス活性を持つ化合物を発見したので、次の段階に移っています。
研究が、ますます面白くなっていくのは、ここからです！
研究室の出来事 2024年 ②
「海綿に含まれる onnamide A (オンナミド A) が新型コロナウイルスの感染を
抑制することを発見しました」2024年 5月
Yasuhiro Hayashi, Nanami Higa, Tetsuro Yoshida, Trianda Ayuning Tyas, Kanami Mori-Yasumoto, Mina Yasumoto-Hirose, Hideki Tani, Junichi Tanaka, Takahiro Jomori
The Journal of Biochemistry, 176, 197-203, 2024
沖縄県の海綿より新型コロナウイルス (SARS-CoV-2) の感染を抑制する化合物 onnamide A を発見しました。SARS-CoV-2 特異的な治療法は世界中で既に確立されつつあります。しかしながら、今夏には、新しい変異株 KP.3 株が海外だけでなく国内でも主流株として出現し、いまだ SARS-CoV-2 感染流行には終わりが見えない状況です。そこで、変異による既存の治療薬への耐性株の出現が懸念され、新しい機序の抗SARS-CoV-2 薬剤を探索することは非常に重要です。
琉球大学 理学部 の田中先生、城森先生が作製された沖縄県の海洋生物ライブラリーを用いて、抗ウイルス活性を持つ抽出液のスクリーニングを行いました。その結果、沖縄県 恩納村 万座で採取した Theonella swinhoei 抽出液に高い抗 SARS-CoV-2 活性を持つことを明らかにしました。城森先生グループにより海綿抽出液を液体クロマトグラフィーで分画し、林研究室では分画サンプルの抗ウイルス活性を測定しました。その結果、onnnamide A を抗ウイルス活性の活性本体として同定しました。興味深いことに、onnamide A はアルファ株、デルタ株、オミクロン株といった様々なSARS-CoV-2株に抗ウイルス活性を持つことが分かりました。
海外の研究者により、onnamide A はSARS-CoV-2 のメインプロテアーゼ酵素（3CLPro）と結合し、感染を抑制することがパソコンを用いたシミュレーションより予測されていました。しかしながら、実際に 3CLPro を onnamide A で処理しても、その酵素活性は阻害されないことが分かりました。この成果は、シミュレーションの予測では本当のことは分からないという、実際に手を動かして研究成果を出すことの重要性を意味しています。現在までに、私たちは、onnamide A がウイルスの侵入過程を部分的に抑制することを明らかにしています。その作用機序を明らかにすることが今後の課題です。
本研究は琉球大学の田中先生・城森先生、東京理科大学の安元先生、一般社団法人トロピカルテクノプラスの廣瀬先生、沖縄県工業技術センターの荻先生との共同研究であり、沖縄イノベーション・エコシステム共同研究推進事業（大学等共同研究推進）の助成を受けたものです。
研究室の出来事 2024年 ①
「研究室に学部3年生が配属されました」2024年 ５月
研究室に学部3年生が配属されました。岩瀬君、小園君の2名です。岩瀬君はコツコツ研究が出来る子で、小園君は好奇心が強い子です。研究にどっぷりつかりましょう。
期待しています。
研究室の出来事 2023年 ⑦
「年末のお掃除」2023年 12月
年末の大掃除をしました。ワックスをかけ研究室はピカピカになりました。夜は、忘年会を行いました。1年間、お疲れさまでした。来年も、良い研究をし、飛躍の1年にしましょう。
研究室の出来事 2023年 ⑥
「研究室ゼミが充実してきました」2023年 9月
新しい3年生が配属されましたので、研究室ゼミの充実に取り掛かりました。毎週金曜日はJournal クラブで論文を Powerpoint でまとめてプレゼンします。毎週月曜日はグループ meetingでは、実験ノートを見ながら、皆で研究の進め方を議論しています。
今月から、月1回の Progress ゼミを始めました。実験データを Word にまとめて発表します。自分の研究を定期的にまとめるというのは、とても大事です。栄えある第1回の発表者は 3年生の吉田君でした。研究室に配属されて間もないですが、しっかりしたデータを出し、
きちんと発表しました。とても嬉しかったです。吉田君、よく頑張りました！
研究室の出来事 2023年 ⑤
「美味しいメロンありがとうございます」2023年 7月
北海道出身の吉田君がルピアレッド「ふらのメロン」をごちそうしてくれました。ご両親が送って頂いたメロンのお裾分けです。とても美味しかったです。親元から遠い宮崎で、吉田君は良い研究がしたいと頑張っています！体には気を付けるんだよ。
研究室の出来事 2023年 ④
「研究室ゼミが盛り上がっています」2023年 6月
新たに研究室に配属した学部3年生も研究室ゼミに参加しました。
① 質問に悪い質問はない。
② 分からないことを聞くことは、新たな発見を産む。
を、ゼミのモットーにしています。
みんな積極的に質問して活発なゼミになりました。良い論文を読むことは良い研究成果につながります。みんなの頑張りに期待しています。
研究室の出来 事 2023年 ③
「研究室の引っ越し」2023年 6月
研究棟の改修工事が終わり、研究室の引っ越しです。新しい研究室で新しい発見をしていきましょう。皆で、頑張りましょう！
研究室の出来事 2023年 ②
「研究室に学部3年生が配属されました」2023年 ５月
研究室に学部3年生が配属されました。有薗君、堀岡君、吉田君の3名です。研究がしたいという気持ちが溢れる頼もしい学生達です。コロナも収まってきましたので歓迎会を行いました。
もうすぐ研究棟の改修工事が終わり、研究室に戻れます。引っ越し後は、研究にどっぷりつかりましょう。期待しています。
研究室の出来事 2023年 ①
「4-HPR が新型コロナウイルスの感染を抑制するメカニズムの発見に関する論文を発表」2023年 3月
Yasuhiro Hayashi, Xuhao Huang, Takashi Tanikawa, Kazunari Tanigawa, Mizuki Yamamoto, Jin Gohda, Jun-Ichiro Inoue, Koichi Fukase, Kazuya Kabayama
Reactive oxygen species are associated with the inhibitory effect of N-(4-hydroxyphenyl)-retinamide on the entry of the severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2
The Journal of Biochemistry, 173, 337–342, 2023
脂質代謝酵素の阻害剤 4-HPR による新型コロナウイルス (SARS-CoV-2) の感染抑制メカニズムを明らかにしました (Hayashi et al., JB, 2023)。これまでの研究で、私達はスフィンゴ脂質代謝酵素 DEGS1 の阻害剤である 4-HPR が SARS-CoV-2感染を抑制すること (Hayashi et al., Journal of Virology, 2021)、そして4-HPRによる SARS-CoV-2 感染抑制には DEGS1 は関与しないことを明らかにしていました (Hayashi et al., BPB, 2022)。しかしながら、4-HPR が、どのようなメカニズムで SARS-CoV-2 感染を抑制するのかは分かっていませんでした。そこで、今回の論文では、4-HPR が酸化剤であることに注目し、活性酸素とSARS-CoV-2 感染の関係について調べました。
従来の報告通り、4-HPR処理により細胞内の活性酸素量が上昇し、抗酸化剤トコフェロールにより細胞内の活性酸素量が減少しました。興味深いことに、SARS-CoV-2 のスパイクタンパク質を介した宿主細胞との膜融合を解析したところ、細胞内の活性酸素量と膜融合の低下は相関することが分かりました。さらに、大阪大学の樺山先生の研究チームにより、4-HPR 処理により 、宿主細胞の脂質二重膜の流動性および SARS-CoV-2 受容体 ACE2 の流動性が低下することが分かりました。今回の論文により、 4-HPR は 細胞内の活性酸素量を増加させ、宿主細胞の脂質二重膜およびウイルス受容体の流動性を低下することで、SARS-CoV-2感染を抑制するという 4-HPR 感染抑制のメカニズムが明らかになりました。
本研究は大阪大学の樺山先生、帝京大学の谷川先生、城西大学の谷川先生との共同研究です。
研究室の出来事 2022年⑤
「脂質代謝酵素阻害剤 4-HPR が新型コロナウイルスの感染を抑制する
メカニズムの発見に関する論文を発表」2022年 10月
Yasuhiro Hayashi, Kouki Matsuda, Kazunari Tanigawa, Takashi Tanikawa, Kenji Maeda, Kiyoto Tsuchiya
Dihydroceramide Δ4-Desaturase 1 Is Not Involved in SARS-CoV-2 Infection
Biological and Pharmaceutical Bulletin, 45, 1559-1563, 2022
脂質代謝酵素の阻害剤 4-HPR による新型コロナウイルスの感染抑制には、スフィンゴ脂質代謝酵素 DEGS1 が関わならいことを明らかにしました (Hayashi et al., BPB, 2022)。昨年、スフィンゴ脂質代謝酵素 DEGS1 の阻害剤である 4-HPR が、新型コロナウイルスの感染も抑制することを私たちの研究で明らかにしていました (Hayashi et al., Journal of Virology, 2021)。しかしながら、DEGS1 酵素と新型コロナウイルス感染の関りは十分に分かっていませんでした。今回発表した論文では、サル腎臓細胞の DEGS1 遺伝子をゲノム編集で変異させ、DEGS1 酵素活性を失った細胞 (DEGS1 ノックアウト細胞) を作製しました。野生型のサル腎臓細胞とDEGS1 ノックアウト細胞で新型コロナウイルスに対する感染効率を調べた結果、2つの細胞に違いはありませんでした。今回の論文により、 4-HPR は DEGS1 非依存的に新型コロナウイルスの感染を抑制するという 4-HPR 感染抑制のメカニズムの一端が明らかになりました。本論文は Featured Article に選ばれました。近日中に、さらに詳細なメカニズムを明らかにした研究成果を発表できるように頑張りますので、ご期待ください。
本研究は国立国際医療研究センターの土屋先生、鹿児島大学の前田先生、帝京大学の谷川先生、城西大学の谷川先生との共同研究です。
研究室の出来事 2022年④
「研究室（仮）に引っ越し」2022年 7月
研究棟の改修工事のため、研究室・教員室を引っ越しました。学生達は前日まで梱包に精を出してくれました。私は引っ越し日でもウエスタンブロッティングをやっていましたが、、、、。研究室の広さは、これまでの3分の1になり、教員室と研究室が歩いて約10分と、なにかと不便ですが、改修工事後の綺麗な研究室を楽しみにして、1年間乗り切ろうと思います。
研究室の出来事 2022年③
「研究室ゼミ、始めました」2022年 7月
研究室ゼミを開始しました。担当者は、きちんと準備をしていて良い発表でした。また多く質問し、活発なゼミになりました。
研究室では、毎週木曜日に論文紹介ゼミを行います。秋からは、研究の進捗ゼミも開始し、週2回のゼミを行います。参加を希望される場合は、林までご連絡ください。また、1～2年生のアポなし飛び入り参加をお待ちしております。研究室見学を兼ねてお越しください。
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研究室の出来事 2022年②
「研究室に学部3年生が配属されました」2022年 ５月
研究室に学部3年生2名が配属されました。細胞培養のトレーニングから実験開始です。もうすぐ研究棟の改修工事ため、研究室の引っ越しがあり、ドタバタします。引っ越し後は、研究にどっぷりつかりましょう。期待しています。
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研究室の出来事 2022年①
「ハンセン病の新たな治療薬の開発に関する論文を発表」2022年 2月
Kazunari Tanigawa, Yasuhiro Hayashi, Akira Kawashima, Mitsuo Kiriya, Yasuhiro Nakamura, Yoko Fujiwara, Yuqian Luo, Mariko Mikami, Ken Karasawa, Koichi Suzuki
The Role of Lipids in the Intracellular Parasitization of Mycobacteriumleprae: Mini-Review
J Appli Microbiol Open Access, 8, No:1000213, 2022
帝京大学薬学部の谷川先生グループとの共同研究により、ハンセン病の起因菌である「らい菌」の感染に脂質トリアシルグリセロールの蓄積が重要であることを発見しました (Tanigawa et al., PLOS ONE, 2021)。トリアシルグリセロールは動植物体でエネルギー貯蔵体として働いていますが、らい菌はマクロファージを宿主として感染することでトリシルグリセロール合成を促進することが分かりました。トリアシルグリセロール合成酵素を遺伝子破壊した宿主細胞では、らい菌の感染や生存率が低下しました。本研究成果より、トリアシルグリセロール量を制御することで、ハンセン病の治療薬として応用できることが期待できます。今回の論文では、2021年に報告した原著論文の結果をもとに、らい菌感染における脂質の機能に関する研究をまとめました。
着任の挨拶
2022年1月1日
宮崎大学 農学部 海洋生物環境学科に准教授として林が着任しました。本学科の個人研究室の1つとして林研を立ち上げます。皆様よろしくお願いいたします。
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